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催化三聯體

催化三聯體，又稱催化金三角，通常指在水解酶和轉移酶的活性位點中心同時作用的三個氨基酸殘基（如蛋白酶、酰胺酶、酯酶、酰基轉移酶、脂酶和β-內酰胺酶）。用於共價催化的親核殘基一般是酸-鹼-親核三聯體[1][2]。殘基會形成一個電荷中繼網絡，以極化和活化親核試劑，來進攻基質形成共價中間體，然後中間體水解，再生出遊離的酶。親核試劑大多是絲氨酸或半胱氨酸，也有少量是蘇氨酸。

與基質（黑）結合的酶（TEV蛋白酶1lvm），示催化三聯體的殘基（紅）。三聯體由酸性殘基（Acid）、組氨酸（His）和親核體（Nuc）組成。在TEV蛋白酶中，酸是天冬氨酸，親核體是半胱氨酸。

因為酶會摺疊成複雜的三維結構，催化三聯體的殘基可能在其所在的氨基酸序列（一級結構）中離得很遠，但最後它們將會摺疊到一起。

雖然在功能上（甚至是三聯體中的親核體）進化趨異，催化三聯體卻是趨同進化的最好案例。對催化的化學約束使得至少23個獨立的蛋白質超家族進化出了相同的催化方法[2]。生物化學中，研究得最透徹之一的就是這些反應的作用機理[3][4]。

歷史

早在20世紀30年代，就有人最早研究出了胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的結構[5]。20世紀50年代，胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶所含三聯體中的絲氨酸被確認為親核體（通過二異丙基氟磷酸鹽的轉變）[6]。20世紀60年代，對其他蛋白酶測序後發現了一系列的相關結構[7][8][9]，現在稱之為S1家族。同時，在木瓜和枯草桿菌蛋白酶的結構中也發現了類似的三聯體，而它們在進化中毫不相干。20世紀60年代末，「電荷中繼」機制提出，解釋了親核體如何被其他三聯體成分所活化[10]。70和80年代，隨着X射線晶體學測定了越來越多的蛋白質結構，發現了同源（如TEV蛋白酶）和非同源但類似（例如木瓜蛋白酶）的三聯體[11][12][13]。20世紀90年代和2010年代，MEROPS分類系統開始將蛋白酶分類為結構相關的酶超家族，從而作為三聯體在20個超家族趨同進化的一個數據庫[14][15]。使得這麼多酶家族歸於同一三聯體形狀的進化化學約束條件於2010年代開始研究[2]。在催化三聯體的電荷中繼及共價催化機制上的大量工作使其成為生物化學中研究得最為透徹的部分之一[3][4]。

成分

 
蛋白酶中常見的催化三聯體電荷中繼系統。酸殘基（通常為穀氨酸或天冬氨酸）對齊並極化鹼（通常為組氨酸），以活化親核體（通常為絲氨酸或半胱氨酸，偶見蘇氨酸）。三聯體降低了親核殘基的pKa，然後進攻基質。氧陰離子穴一般會為酰胺骨架充上正電荷（偶爾為側鏈），使電荷在過渡態的基質上穩定聚集

親核體

側鏈上的親核殘基可共價催化基質。氧或硫上的孤對電子會進攻正電的羰基碳。20種天然生物氨基酸沒有足夠的親核性官能基以催化許多困難的反應。最常見的親核體是絲氨酸的醇（OH）和半胱氨酸的硫醇/硫醇鹽離子（SH/S-）。在三聯體中嵌入親核體提高了它的催化活性。一些蛋白酶採用的是蘇氨酸的仲醇，然而由於額外甲基的緣故，這些蛋白酶使用N端氨基附近的一個水分子作為鹼，而不是一個單獨的氨基酸[1][16]。

鹼

由於所有的天然氨基酸都不具有強親核性，催化三聯體中的鹼極化並脫去親核體的質子，以提高其反應活性。此外，它還能質子化第一個生成物，以幫助離去基離開。其最常見為組氨酸，因為它的pKa值有助於高效的鹼催化，同時可與酸殘基以氫鍵結合，及對親核殘基去質子化。β-內酰胺酶如TEM-1使用離胺酸殘基作為鹼。由於離胺酸的pKa值如此之高（pKa=11），在循環催化的過程中，穀氨酸等幾個殘基要充當酸以穩定其去質子化的狀態[17][18]。為了避免位阻效應，蘇氨酸蛋白酶以N端氨基附近的一個水分子作為鹼，以提高用於催化的蘇氨酸殘基的反應活性[19][20]。

酸

酸性殘基能對齊並極化鹼性殘基。其通常為天冬氨酸或穀氨酸。有些酶只有一個二分體，例如在半胱氨酸蛋白酶中三聯體的酸就不是非常必要。如木瓜蛋白酶中的第三個三聯體成分為天冬酰胺，它能引導組氨酸轉變為鹼，但卻不作為酸出現。類似地，甲型肝炎病毒蛋白酶的序列中含有一個水分子，而那個位置本該是一個氨基酸殘基。另外，巨細胞病毒蛋白酶使用一對組氨酸，一個作為鹼，另一個則如在其它的酶中那樣作為酸[1]。作為酸而言，第二個組氨酸較常見的天冬氨酸或穀氨酸效率要低，因而其催化效率也不是很高。

範例

 
不同的氨基酸殘基組合構成了各個酶中用於水解的催化三聯體。左邊是三聯體中的親核體、鹼和酸成分。右邊是不同的基質，以剪刀指示將斷裂的鍵。β-內酰胺中可以斷開兩個不同的鍵（1：青黴素酰化酶，2：β-內酰胺酶）

絲氨酸-組氨酸-天冬氨酸

胰凝乳蛋白酶（PA超家族，S1家族）是幾個典型含三聯體的酶之一。它使用絲氨酸-組氨酸-天冬氨酸序列以水解蛋白。

  1. 胰凝乳蛋白酶結合基質，為一個含有大量疏水殘基的大環。
  2. 天冬氨酸與組氨酸以氫鍵（可能是低能障氫鍵）結合，將其咪唑氮的pKa從7增加至約12。這使得組氨酸變為一種強的廣義鹼，可將絲氨酸去質子化。
  3. 絲氨酸作為親核體進攻羰基碳原子，並迫使羰基氧接受電子，形成了一個四面體形狀的中間體。中間體由氧陰離子穴所穩定，其中涉及到骨架上的絲氨酸酰胺。
  4. 中間體羰基的返還導致組氨酸的質子轉移到附着在α碳上的氮原子上。氮和所連接的C端肽片段通過擴散的方式離去。
  5. 水分子再給出一個質子到組氨酸上，剩下的OH-進攻羰基碳，形成另一個四面體中間體。OH較C端片段離去性能較差，因此，當四面體中間體再次反應，酶中的絲氨酸從組氨酸處重新獲得質子。
  6. 被切割下來肽的N端擴散離去。

其它的α/β水解酶通過趨同進化也發展出了同樣的三聯體，如一些脂肪酶和酯酶，但是手性與之相反。此外，與G蛋白的摺疊相同的腦乙酰水解酶中也發現了這樣的三聯體。乙酰膽鹼酯酶中有等效的絲氨酸-組氨酸-穀氨酸三聯體。

半胱氨酸-組氨酸-天冬氨酸

半胱氨酸蛋白酶的幾個家族使用這個三聯體組，例如煙草花葉病毒蛋白酶（PA超家族，C4家族）和木瓜蛋白酶（CA超家族，C1家族）。其作用類似於絲氨酸蛋白酶中的三聯體，它們之間的差異將在下文「絲氨酸和半胱氨酸水解酶機制的比較」一節中闡述。目前尚不清楚天冬氨酸對木瓜蛋白酶中三聯體的催化作用和幾種半胱氨酸蛋白酶（如甲型肝炎病毒蛋白酶）中二分體的高效性有何重要作用。

絲氨酸-組氨酸-組氨酸

巨細胞病毒蛋白酶（SH超家族，S21家族）同時使用組氨酸作為三聯體中的酸和鹼。除去酸性組氨酸僅使活性降低了10倍（與之相比，從胰凝乳蛋白酶中除去天冬氨酸活性會降低>10,000倍）。有人認為這個三聯體可能是用來降低酶的活性，以控制卵裂速率[16]。

絲氨酸-穀氨酸-天冬氨酸

在Sedolisin蛋白酶(SB超家族, S53家族)中，人們發現了這種不尋常的三聯體。由於穀氨酸羧基pka值較低，只有在較強的酸性環境下它才能充當三聯體中的鹼性基團。有人認為這種酶的存在可能是為了滿足生物在特定酸性環境下（例如酸性溫泉中、溶酶體內）的催化需求[16]。

蘇氨酸-水-N端氨基

蘇氨酸蛋白酶，例如蛋白酶體中的蛋白酶亞基（PB超家族，T1家族）和鳥氨酸乙酰基轉移酶（PE超家族，T5家族），使用這個三聯體組。在該三聯體組中，蘇氨酸的二級醇羥基作為親核基團，以代替絲氨酸中的一級醇羥基。[19][20] 由於蘇氨酸末端甲基的空間位阻效應，如果形成普通的三聯體則反應時基質就會與末端甲基發生排斥作用，致使定向變為不可能。所以這種酶起催化作用的蘇氨酸位於其N端，N端氨基起到三聯體酸性基團的作用。在催化過程中，氨基氮原子與酶分子內部的一個有序排列的水分子形成氫鍵並使之極化，從而令水分子奪取蘇氨酸羥基上的質子，使得後者的反應活性（親核性）大大加強，最終與基質發生反應。[1][16]

絲氨酸-水-N端氨基和半胱氨酸-水-N端氨基

亦存在以絲氨酸-水-N端氨基或半胱氨酸-水-N端氨基為三聯體的酶，例如青黴素G酰胺水解酶（PB超家族，S45家族）和青黴素V酰胺水解酶（PB超家族，S59家族）。就進化的角度而言，這些酶與蘇氨酸蛋白酶存在關聯，其作用機制亦與後者類似[16]。

絲氨酸-(cis)-絲氨酸-離胺酸

這種不尋常的三聯體僅出現在酰胺水解酶的一個超家族中。含這種三聯體的酶在催化反應中，離胺酸氨基先極化處於中間位置的絲氨酸，使其羥基分別與另一（作為親核試劑的）絲氨酸的羥基和骨架上的酰胺基形成兩根強氫鍵，從而提高了（親核）絲氨酸的反應活性。該三聯體中部的絲氨酸採取反常的順式取向，以保證其與另外兩個氨基酸殘基可以精確接觸。更加不同尋常的是，在該三聯體中，中間位置的絲氨酸與離胺酸均起到其他三聯體中鹼性基團的作用，即加強（親核）絲氨酸的反應活性。與此同時離胺酸又起到酸性基團的作用。[21]

絲氨酸和半胱氨酸水解酶機制的比較

這一部分所有的論述及列出的所有參考文獻均是針對蛋白酶的研究，不過這些酶的作用機制可以推廣到所有絲氨酸和半胱氨酸水解酶。

 
半胱氨酸蛋白酶（上）與絲氨酸蛋白酶（下）催化機理之差異。其中酶分子用黑色標識，蛋白質基質用紅色標識。兩種機理之差異在於：（a）巰基電離 （b）酸性基團可以沒有 （c）羥基脫質子與進攻協同 （d）酸、鹼性基團間形成氫鍵 （e）離去部分與鹼性基團必須精確配合 （f）絲氨酸離去基團需質子化

作親核催化的酶依靠一系列空間位置接近的活性殘基來獲得催化活性。這個活性中心系統是如此的精密和完美，以致活性中心及其相鄰氨基酸序列在同一家族的各酶中具有最高的相似性，亦即在進化中幾乎保持不變，這種性質稱為保守性。[22]在催化三聯體中，最常見的親核基團是絲氨酸的醇羥基和半胱氨酸的硫醇巰基。與氧原子相比，硫原子電子層數多了一層。這使得硫原子的原子半徑更大（大約大了0.4 Å），且更易變形。就軟硬酸鹼理論的角度而言，硫負離子比氧負離子是更「軟」的鹼。雖然硫的電負性比氧小，但硫原子還擁有空的3d軌道可充填電子。因而硫負離子是比氧負離子更弱的鹼。（例如HS-的Kb值比OH-大七個數量級）[23][24]

參見：親核酰基取代反應

催化反應的第一步是親核基團對基質羰基進攻，形成四面體中間體（Ⅰ）的過程。半胱氨酸巰基之pKa值是如此之低，以至於部分半胱氨酸蛋白酶（例如木瓜蛋白酶）在基態下催化三聯體中半胱氨酸巰基氫是電離的（見(a)）。[25]一些甚至不需要酸性基團參與即能有效催化反應（見(b)）。催化過程中，已電離的烷硫負離子可以直接進攻基質羰基。然而，在絲氨酸蛋白酶中，絲氨酸羥基pKa值較大，不容易電離。因此，絲氨酸蛋白酶在催化反應時，酸性基團-鹼性基團從絲氨酸羥基上奪氫和產生的烷氧負離子對基質羰基的親核進攻，這兩個過程是協同進行的（見(c)）。顯然這種情形下，三聯體中酸性基團和鹼性集團採取有利的取向並形成氫鍵（見(d)），會加強鹼性基團之鹼性，促進羥基氫的脫去，進而加快酶的催化速率。[24]

第二步是四面體中間體（Ⅰ）分解產生一個產物和中間產物酯或硫酯的過程。這是一個親核消除反應，故離去基團的離去性越好，消除越易進行。對兩種蛋白酶而言，這步反應的離去基團是胺負離子（當然其他酶可依此類推），而後者鹼性極強，不是好的離去基。因而四面體中間體在分解前（或分解同時），需要對其離去部分進行質子化，從而使離去基團變成一個中性的胺，以確保反應能夠順利進行。事實上，酶的空間結構保證了中間體（或胺負離子）和三聯體中的鹼性基團（在第一步反應後一定處於質子化狀態）具有正確的取向，能夠發生質子交換。值得注意的是，該中間體不僅能夠分解產生中間產物，還能夠分解產生反應物，即第一步反應是可逆的。其逆反應機理與第二步反應類似（本質上說，這兩個反應為平行反應），故上述討論同樣適用。考慮到巰基負離子是很好的離去基團，對半胱氨酸蛋白酶這步逆反應速率也較大，即該酶形成的中間體（Ⅰ）轉化為中間產物的轉化率較低，這也是該酶的一個不足之處。[2]因而上述的正確取向對半胱氨酸蛋白酶顯得尤為重要，只有兩者精確配合，才能抗衡逆反應帶來的不利因素。（見(e)）

接着另一反應物（對蛋白酶而言為水，其餘酶依此類推）參與反應，產生四面體中間體（Ⅱ）。此反應與第一步反應類似，不同的是，這裏水代替了絲氨酸或半胱氨酸作為親核試劑。當然這一步也是可逆的。最後中間體（Ⅱ）分解，得到另一個產物，酶復原。對半胱氨酸蛋白酶，可以直接產生巰基負離子。對絲氨酸蛋白酶，仍需使中間體（Ⅱ）在分解時奪走鹼性基團上的一個質子。（見(f)）

與氧相比，硫的原子半徑較大，所成共價鍵較長，需要匹配更大的活性位點。[26]故某個絲氨酸蛋白酶催化三聯體中的絲氨酸變異成了半胱氨酸，或是半胱氨酸蛋白酶催化三聯體中的半胱氨酸變異成了絲氨酸，均會失去活性。因為它們結合基質後，各基團的取向不對。例如，對硫代胰蛋白酶的晶體結構研究證實，其中的半胱氨酸不僅沒有與基質接近，反而與氧陰離子穴發生了相互作用。[23]

酶的進化專一化使得蛋白酶催化三聯體中的親核基團具有不可代替性[25][27][28][29][30][31][32]（當然在絕大多數其他酶中也是如此[33][34][35][36][37][38]），否則會導致其反應性降低，結構與基質不匹配，進而使其催化活性急劇下降（超過四個數量級）。

趨異演化

 
趨異演化導致同一超家族各酶三聯體運用的親核試劑不同。圖為胰凝乳蛋白酶（PA超家族，S1家族）的絲氨酸三聯體和煙草花葉病毒蛋白酶（PA超家族，C3家族）的半胱氨酸三聯體。

儘管各酶的化學性質有上述的差異，很明顯某幾種超家族的蛋白酶均使用不同的氨基酸作為親核試劑是趨異演化的結果。這可以從如下的事實推斷出：有數種蛋白酶超家族（相同摺疊類型）含有運用不同氨基酸作為親核試劑的家族。這表明在進化史上，三聯體中親核試劑的改變曾屢次發生，儘管這種改變的機制目前還不清楚。

在包含運用不同氨基酸作為親核試劑的蛋白酶的超家族中（例如PA族），各家族的劃分是以它們三聯體中的親核試劑為依據的。(S=絲氨酸蛋白酶, C=半胱氨酸蛋白酶，T=蘇氨酸蛋白酶)

超家族 家族 例子
PA族 C3, C4, C24, C30, C37, C62, C74, C99 煙草花葉病毒蛋白酶 (煙草花葉病毒)
S1, S3, S6, S7, S29, S30, S31, S32, S39, S46, S55, S64, S65, S75 胰凝乳蛋白酶 (哺乳動物, 例如 家牛)
PB族 C44, C45, C59, C69, C89, C95 磷酸核糖焦磷酸氨基轉移酶 前體 (人類)
S45, S63 青黴素G酰胺水解酶 前體 (大腸桿菌)
T1, T2, T3, T6 古菌蛋白酶體, β單元 (Thermoplasma acidophilum)
PC族 C26, C56 γ-麩胺醯水解酶 (褐鼠)
S51 二肽酶E (大腸桿菌)
PD族 C46 刺蝟蛋白 (黑腹果蠅)
N9, N10, N11 內含肽 含有V型質子轉運ATP酶 催化亞基A (釀酒酵母)
PE族 P1 DmpA氨肽酶 (Ochrobactrum anthropi)
T5 鳥氨酸乙酰基轉移酶 前體 (釀酒酵母)

趨同演化

 
趨同進化使得不同的酶中出現了相同排列、相同空間結構的催化三聯體：酸性基團-鹼性基團-親核基團。圖示為枯草桿菌蛋白酶(SB超家族, S8家族)，prolyl oligopeptidase (SC超家族, S9家族), 煙草花葉病毒蛋白酶（PA超家族，C3家族）和木瓜蛋白酶 (CA超家族, C1家族)的催化三聯體。

對蛋白酶的酶學研究為趨同演化理論提供了最清晰的證據。在不同的超家族中，具相同排列和結構的三聯體曾經歷了超過20次的獨立演化。這是因為雖然酶作為一種蛋白質，其氨基酸排列方式有無數種，但是其中只有按照少數幾種方式排列才能形成具有催化作用的酶——化學性質使然。這導致了具有相同結構的酶被各種生物重複地、獨立地演化出來。[1][2]

絲氨酸與半胱氨酸水解酶

絲氨酸與半胱氨酸水解酶運用不同的氨基酸官能基（醇羥基或硫醇巰基）作親核基團。為活化親核基團，這些酶中均含有指向該基團的酸性殘基和鹼性殘基。這三個基團形成了催化三聯體。化學、物理性質對酶催化活性的約束導致了不同的超家族中，具相同結構排列的三聯體經歷了超過20次的獨立演化。[2]

相同空間結構的三聯體集中於絲氨酸蛋白酶（例如枯草桿菌蛋白酶和胰凝乳蛋白酶所屬的超家族）和半胱氨酸蛋白酶（例如煙草花葉病毒蛋白酶和木瓜蛋白酶所屬的超家族）。重要的是，由於兩種酶催化機理相近，所有三聯體擁有幾乎相同的排列。

蛋白質超家族 半胱氨酸蛋白酶家族 例子
CA C1, C2, C6, C10, C12, C16, C19, C28, C31, C32, C33, C39, C47, C51, C54, C58, C64, C65, C66, C67, C70, C71, C76, C78, C83, C85, C86, C87, C93, C96, C98, C101 木瓜蛋白酶 (木瓜) and 鈣蛋白酶 (人類)
CD C11, C13, C14, C25, C50, C80, C84 胱天蛋白酶-1 (褐鼠) and 分離酶 (釀酒酵母)
CE C5, C48, C55, C57, C63, C79 腺病毒內肽酶 (人類腺病毒2型)
CF C15 焦麩胺醯肽酶I (解澱粉芽孢桿菌)
CL C60, C82 轉肽酶A (金黃色葡萄球菌)
CM C18 丙型肝炎病毒蛋白酶2 (丙肝病毒)
CN C9 sindbis病毒型nsP2肽酶 (sindbis病毒)
CO C40 二肽酰肽酶VI (Lysinibacillus sphaericus （頁面存檔備份，存於互聯網檔案館）)
CP C97 DeSI-1肽酶 (小家鼠)
PA C3, C4, C24, C30, C37, C62, C74, C99 煙草花葉病毒蛋白酶 (煙草花葉病毒)
PB C44, C45, C59, C69, C89, C95 磷酸核糖焦磷酸氨基轉移酶 前體 (人類)
PC C26, C56 γ-麩胺醯水解酶 (褐鼠)
PD C46 刺蝟蛋白 (黑腹果蠅)
PE P1 DmpA氨肽酶 (Ochrobactrum anthropi)
未分類 C7, C8, C21, C23, C27, C36, C42, C53, C75
蛋白質超家族 絲氨酸蛋白酶家族 例子
PA S1, S3, S6, S7, S29, S30, S31, S32, S39, S46, S55, S64, S65, S75 胰凝乳蛋白酶 A (家牛)
PB S45, S63 青黴素G酰胺水解酶 前體 (大腸桿菌)
PC S51 二肽酶E (大腸桿菌)
PE P1 DmpA氨肽酶 (Ochrobactrum anthropi)
SB S8, S53 枯草桿菌蛋白酶 (地衣芽孢桿菌)
SC S9, S10, S15, S28, S33, S37 脯肽酰內肽酶 (野豬)
SE S11, S12, S13 D-丙氨酸-D-丙氨酸肽酶C (大腸桿菌)
SF S24, S26 信號肽酶 I (大腸桿菌)
SH S21, S73, S77, S78, S80 巨細胞病毒assemblin (人類疱疹病毒5)
SJ S16, S50, S69 lon-A蛋白酶 (大腸桿菌)
SK S14, S41, S49 Clp蛋白酶 (大腸桿菌)
SO S74 噬菌體K1F內切唾液酸酶CIMCD自切斷蛋白 (腸細菌噬菌體K1F)
SP S59 核孔蛋白145 (人類)
SR S60 乳鐵蛋白 (人類)
SS S66 murein tetrapeptidase LD-carboxypeptidase (綠膿桿菌)
ST S54 rhomboid-1 (黑腹果蠅)
未分類 S48, S62, S68, S71, S72, S79, S81

蘇氨酸蛋白酶

 
蘇氨酸蛋白酶向着以N端作為活性位點的方向趨同進化。圖示為蛋白酶體和鳥氨酸乙酰基轉移酶中起催化作用的N端絲氨酸。

蘇氨酸蛋白酶以蘇氨酸作為親核試劑。正如前文所述，蘇氨酸含有二級醇羥基，由於末端甲基的位阻效應無法形成通常的三聯體。因此通常情形下，蘇氨酸蛋白酶運用N端蘇氨酸作親核試劑以避免該問題。

有數個屬於不同蛋白質摺疊類的酶超家族獨立演化出了以N端蘇氨酸殘基作親核試劑的三聯體，包括PB超家族（蛋白酶體運用Ntn摺疊）[19]和PE超家族（乙酰基轉移酶運用DOM摺疊）。[20]這種不同摺疊類的酶在活性中心結構上的共同點表明在這些超家族中，活性中心是趨同演化的。[2][16]

蛋白質超家族 蘇氨酸蛋白酶家族 例子
PB clan T1, T2, T3, T6 古菌蛋白酶體, β亞基 (Thermoplasma acidophilum)
PE clan T5 鳥氨酸乙酰基轉移酶 (釀酒酵母)

參見

參考

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