分枝DNA
分枝DNA讯号放大技术(英文:branched DNA,缩写:b-DNA),是一种讯号放大技术,可用于检测DNA及RNA,不同于一般是用PCR扩增目标序列,b-DNA并没有扩增序列,也因此不易受污染产生的非专一性序列影响,也比PCR更能忍受目标序列变异造成的影响 ,目前常用于监控HIV及HCV病毒载量[1][2]。
原理
在固定支撑物上(如96孔盘)固定捕捉探针,再加入叫抓取扩展分子(Capture extender,CEs)的寡核苷酸,它用来抓取目标物并将其固定在固定支撑物,之后加入样品让CEs杂交抓取固定住,接着加入标签扩展分子(Label extenders,LEs)(为靶序列专一性寡核甘酸)结合标定。
此技术可分为一代及二代、三代,第一代中,LEs结合分枝DNA讯号放大分子(branched DNA amplifier,bDNA),bDNA再结合数个碱性磷酸酶探针(alkaline phosphatase probe),而在二代及三代LEs则是先结合了前置讯号放大分子(preamplifier),再结合bDNA,能得到更强的讯号放大,使灵敏度再提升,能侦测到更微量的目标物(从一代的10000提升至500),但也因此可能有非专一性杂交反应产生(如bDNA、preamplifier、碱性磷酸酶探针和非靶序列杂交),会提升背景值。可在设计前述三者时加入30%的异碱基:异胞嘧啶(isocytidine,isoC)及异鸟苷酸(isoguanosine,isoG),这些含异常核苷酸的分子不会和任何正常DNA序列有交互作用,故不会有背景值干扰的问题[3]。
最后加入碱性磷酸酶的萤光受质(如ELF 97、X-Phos)产生化学冷光(chemiluminescence)并使用冷光仪侦测萤光讯号[1]。
参考资料
- ^ 1.0 1.1 Takahashi, Tadanobu; Otsubo, Tadamune; Ikeda, Kiyoshi; Minami, Akira; Suzuki, Takashi. Histochemical imaging of alkaline phosphatase using a novel fluorescent substrate. Biological & Pharmaceutical Bulletin. 2014, 37 (10): 1668–1673 [2019-02-09]. ISSN 1347-5215. PMID 25109307. (原始内容存档于2019-02-09).
- ^ Battersby, Thomas R.; Surtihadi, Johan; Rampersad, Vinod; Kleshik, Felix; Cosenza, Carlo; Canchola, Jesse A.; Brooks, Jesse R.; Beas, Hilda; Zhang, Nan. A Sensitive Branched DNA HIV-1 Signal Amplification Viral Load Assay with Single Day Turnaround. PLOS ONE. 2012-03-27, 7 (3): e33295 [2020-12-21]. ISSN 1932-6203. doi:10.1371/journal.pone.0033295. (原始内容存档于2019-04-27) (英语).
- ^ Ho, David D.; Urdea, Mickey S.; Bushnell, Steve; Kolberg, Janice; Shen, Lu-Ping; Detmer, Jill; Ahle, David; Horn, Thomas; Chang, Chu-an. A branched DNA signal amplification assay for quantification of nucleic acid targets below 100 molecules/ml. Nucleic Acids Research. 1997-08-01, 25 (15): 2979–2984 [2019-02-09]. ISSN 0305-1048. doi:10.1093/nar/25.15.2979. (原始内容存档于2022-03-02) (英语).